クロロフィル・カロテノイド定量方法（アセトン抽出法）

2012/11/21 筑波大学　野田　響

ここでは，アセトンによるクロロフィル・カロテノイド定量方法を解説します。

DMF抽出法は抽出に3日程度かかるが，アセトン抽出法の場合，短時間で抽出から定量まで行えるという利点がある。また，DMFが葉の組織に十分浸透しないようなクチクラ層の発達した葉でも，アセトン抽出法ならクロロフィル・カロテノイドの測定が可能である。ただし，この抽出法では，サンプルの葉の組織を十分に破壊することが必須である。

測定全体の流れ

1. サンプルとなる葉からある面積の切片を切り抜く（この切片をleaf discと呼ぶ），またはサンプルとなる葉の面積を測定する
2. leaf discを低温ですりつぶし（完全に組織を破壊す），そのサンプルに80％アセトンを注ぐ
3. 試験管を遠心分離機にかける
4. 上澄みを分光計で計測
5. 吸光度からクロロフィル・カロテノイド量を算出

• リーフパンチ（あれば便利）

• アセトン
• 蒸留水
• 液体窒素
• 氷，氷水

• ピンセット
• メスシリンダー
• 深めのバットまたはたらい（試験管立てが入る大きさが望ましい）
• 試験管
• 試験管立て
• 撹拌棒
• オートビュレット（あれば便利）
• パラフィルム（試験管と同数をあらかじめ適当な大きさに切っておく）

• 遠心分離機
• 分光光度計
• 石英ガラスのセル（分光光度計用）

• ポリエチレン製手袋
• 白衣・保護ゴーグル

溶媒（80％アセトン）の準備

アセトン8に対して蒸留水2を混ぜよく撹拌した上で，オートビュレット付属瓶に注いでおく。

氷（氷水）の準備

サンプルの温度が上がるとクロロフィルが分解してしまうため，作業中はできる限りサンプルを冷やしておく。氷（氷水）をはったバットに試験管たて・試験管をいれて，作業中は冷やしておけるようにする。

クロロフィル・カロテノイド定量方法（DMF抽出法）参照。

大きなサンプルの場合，乳鉢にサンプルと液体窒素を入れて乳棒ですりつぶし，そこに一定量の80%アセトンを注ぐ。

ここではleaf discなど小さいサンプルの場合について説明する。

1. leaf discを試験管に入れる
2. この試験管に液体窒素を入れ，撹拌棒で凍った葉を細かく砕く（撹拌棒で粉々に割る）
3. 十分に細かくなったら，試験管に80%アセトン4ml（吸光度が1を超えてしまう場合はもっと増やす）を注ぐ。
4. 試験管にふたをする（合うフタがない場合はパラフィルムを使う）
5. 試験管を振って，溶媒が緑に，サンプルの残りかすが白くなっていればOK（残りかすに緑色が残った場合は，上澄みの吸光度測定後，残りかすについて，液体窒素で凍らすところから繰り返す）
6. 試験管は，氷水を張ったバットに立てておいて，温度が上がらないようにしておく

2の試験管の本数がある程度溜まったら，遠心分離機にかけ（5分くらい），葉の残りかすとクロロフィル・カロテノイドの溶けた溶媒とを分離する。

遠心分離機に試験管を並べる際は，バランスよく並べる。

ガラスセルに溶媒を移す

遠心分離機にかけた試験管から，上澄みを石英ガラスセルに静かに注ぐ。うまく注げない場合は，ピペット，ピペットマンを使用し，残りかすがセルに入らないよう，注意する。

試験管に残った溶媒は，すぐに捨てず，またフタをして氷水の中に立てておく（分光光度計での測定に失敗したときの保険として）。

分光光度計

使用する分光光度計については，それぞれマニュアルをよく読むこと。

分光光度計では下記の波長の吸光度を測定する。

Porra et al. (1989) の式を使う場合（クロロフィルa, bのみ）

• 663.6 nm
• 646.6 nm

Wellburn (1994) の式を使う場合（クロロフィルa, b，カロテノイド）

• 663.2 nm
• 646.8 nm
• 470 nm

測定後，セルに残った溶媒は廃液入れに捨てる。

Porra et al. (1989) の式

分子量で表す場合

Chl_a (nmol/ml) = 13.71 * A_663.6 - 2.85 * A_646.6

Chl_b (nml/ml) = 22.39 * A_646.6 - 5.42 * A_663.6

Chl_a+b (nmol/ml) = 19.54 * A_646.6 + 8.29 * A_663.6

重量で表す場合

Chl_a (ug/ml) = 12.25 * A_663.6 - 2.55 * A_646.6

Chl_b (ug/ml) = 20.31 * A_646.6 - 4.91 * A_663.6

Chl_a+b (ug/ml) = 17.76 * A_646.6 + 7.34 * A_663.6

Wellburn (1994) の式

Chl_a (ug/ml) = 12.25 * A_663.2 - 2.79 * A_646.8

Chl_b (ug/ml) = 21.5 * A_646.8 - 5.1 * A_663.2

Car_total (ug/ml) = (1000 * A_470.0 - 1.82 * Chl_a - 85.02 * Chl_b) / 198