とらりもん - クロロフィル・カロテノイド定量方法（2） Diff
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2012/11/21 筑波大学 野田 響
ここでは，アセトンによるクロロフィル・カロテノイド定量方法を解説します。
!はじめに
DMF抽出法は抽出に3日程度かかるが，アセトン抽出法の場合，短時間で抽出から定量まで行えるという利点がある。また，DMFが葉の組織に十分浸透しないようなクチクラ層の発達した葉でも，アセトン抽出法ならクロロフィル・カロテノイドの測定が可能である。ただし，この抽出法では，サンプルの葉の組織を十分に破壊することが必須である。
!!測定全体の流れ
# サンプルとなる葉からある面積の切片を切り抜く（この切片をleaf discと呼ぶ），またはサンプルとなる葉の面積を測定する
# leaf discを低温ですりつぶし（完全に組織を破壊す），そのサンプルに80％アセトンを注ぐ
# 試験管を遠心分離機にかける
# 上澄みを分光計で計測
# 吸光度からクロロフィル・カロテノイド量を算出
!0. 準備するもの
* リーフパンチ（あれば便利）
* アセトン
* 蒸留水
* 液体窒素
* 氷，氷水
* ピンセット
* メスシリンダー
* 深めのバットまたはたらい（試験管立てが入る大きさが望ましい）
* 試験管
* 試験管立て
* 撹拌棒
* オートビュレット（あれば便利）
* パラフィルム（試験管と同数をあらかじめ適当な大きさに切っておく）
* 遠心分離機
* 分光光度計
* 石英ガラスのセル（分光光度計用）
* ポリエチレン製手袋
* 白衣・保護ゴーグル
!!溶媒（80％アセトン）の準備
アセトン8に対して蒸留水2を混ぜよく撹拌した上で，オートビュレット付属瓶に注いでおく。
!!氷（氷水）の準備
サンプルの温度が上がるとクロロフィルが分解してしまうため，作業中はできる限りサンプルを冷やしておく。氷（氷水）をはったバットに試験管たて・試験管をいれて，作業中は冷やしておけるようにする。
!1. leaf discの切り抜き/葉面積の測定
[[クロロフィル・カロテノイド定量方法（DMF抽出法）]]参照。
!2. クロロフィル・カロテノイドの抽出
大きなサンプルの場合，乳鉢にサンプルと液体窒素を入れて乳棒ですりつぶし，そこに一定量の80%アセトンを注ぐ。
ここではleaf discなど小さいサンプルの場合について説明する。
# leaf discを試験管に入れる
# この試験管に液体窒素を入れ，撹拌棒で凍った葉を細かく砕く（撹拌棒で粉々に割る）
# 十分に細かくなったら，試験管に80%アセトン4ml（吸光度が1を超えてしまう場合はもっと増やす）を注ぐ。
# 試験管にふたをする（合うフタがない場合はパラフィルムを使う）
# 試験管を振って，溶媒が緑に，サンプルの残りかすが白くなっていればOK（残りかすに緑色が残った場合は，上澄みの吸光度測定後，残りかすについて，液体窒素で凍らすところから繰り返す）
# 試験管は，氷水を張ったバットに立てておいて，温度が上がらないようにしておく
!3.遠心分離
2の試験管の本数がある程度溜まったら，遠心分離機にかけ（5分くらい），葉の残りかすとクロロフィル・カロテノイドの溶けた溶媒とを分離する。
遠心分離機に試験管を並べる際は，バランスよく並べる。
!4. 吸光度の測定
!!ガラスセルに溶媒を移す
遠心分離機にかけた試験管から，上澄みを石英ガラスセルに静かに注ぐ。うまく注げない場合は，ピペット，ピペットマンを使用し，残りかすがセルに入らないよう，注意する。
試験管に残った溶媒は，すぐに捨てず，またフタをして氷水の中に立てておく（分光光度計での測定に失敗したときの保険として）。
!!分光光度計
使用する分光光度計については，それぞれマニュアルをよく読むこと。
分光光度計では下記の波長の吸光度を測定する。
!!!Porra et al. (1989) の式を使う場合（クロロフィルa, bのみ）
* 663.6 nm
* 646.6 nm
!!!Wellburn (1994) の式を使う場合（クロロフィルa, b，カロテノイド）
* 663.2 nm
* 646.8 nm
* 470 nm
測定後，セルに残った溶媒は廃液入れに捨てる。
!5．クロロフィル（・カロテノイド）量の推定
!!Porra et al. (1989) の式
分子量で表す場合
Chl_a (nmol/ml) = 13.71 * ~~A~~__663.6__ - 2.85 * ~~A~~__646.6__
Chl_b (nml/ml) = 22.39 * ~~A~~__646.6__ - 5.42 * ~~A~~__663.6__
Chl_a+b (nmol/ml) = 19.54 * ~~A~~__646.6__ + 8.29 * ~~A~~__663.6__
----
重量で表す場合
Chl_a (ug/ml) = 12.25 * ~~A~~__663.6__ - 2.55 * ~~A~~__646.6__
Chl_b (ug/ml) = 20.31 * ~~A~~__646.6__ - 4.91 * ~~A~~__663.6__
Chl_a+b (ug/ml) = 17.76 * ~~A~~__646.6__ + 7.34 * ~~A~~__663.6__
!!Wellburn (1994) の式
Chl_a (ug/ml) = 12.25 * ~~A~~__663.2__ - 2.79 * ~~A~~__646.8__
Chl_b (ug/ml) = 21.5 * ~~A~~__646.8__ - 5.1 * ~~A~~__663.2__
Car_total (ug/ml) = (1000 * ~~A~~__470.0__ - 1.82 * Chl_a - 85.02 * Chl_b) / 198
ここでは，アセトンによるクロロフィル・カロテノイド定量方法を解説します。
!はじめに
DMF抽出法は抽出に3日程度かかるが，アセトン抽出法の場合，短時間で抽出から定量まで行えるという利点がある。また，DMFが葉の組織に十分浸透しないようなクチクラ層の発達した葉でも，アセトン抽出法ならクロロフィル・カロテノイドの測定が可能である。ただし，この抽出法では，サンプルの葉の組織を十分に破壊することが必須である。
!!測定全体の流れ
# サンプルとなる葉からある面積の切片を切り抜く（この切片をleaf discと呼ぶ），またはサンプルとなる葉の面積を測定する
# leaf discを低温ですりつぶし（完全に組織を破壊す），そのサンプルに80％アセトンを注ぐ
# 試験管を遠心分離機にかける
# 上澄みを分光計で計測
# 吸光度からクロロフィル・カロテノイド量を算出
!0. 準備するもの
* リーフパンチ（あれば便利）
* アセトン
* 蒸留水
* 液体窒素
* 氷，氷水
* ピンセット
* メスシリンダー
* 深めのバットまたはたらい（試験管立てが入る大きさが望ましい）
* 試験管
* 試験管立て
* 撹拌棒
* オートビュレット（あれば便利）
* パラフィルム（試験管と同数をあらかじめ適当な大きさに切っておく）
* 遠心分離機
* 分光光度計
* 石英ガラスのセル（分光光度計用）
* ポリエチレン製手袋
* 白衣・保護ゴーグル
!!溶媒（80％アセトン）の準備
アセトン8に対して蒸留水2を混ぜよく撹拌した上で，オートビュレット付属瓶に注いでおく。
!!氷（氷水）の準備
サンプルの温度が上がるとクロロフィルが分解してしまうため，作業中はできる限りサンプルを冷やしておく。氷（氷水）をはったバットに試験管たて・試験管をいれて，作業中は冷やしておけるようにする。
!1. leaf discの切り抜き/葉面積の測定
[[クロロフィル・カロテノイド定量方法（DMF抽出法）]]参照。
!2. クロロフィル・カロテノイドの抽出
大きなサンプルの場合，乳鉢にサンプルと液体窒素を入れて乳棒ですりつぶし，そこに一定量の80%アセトンを注ぐ。
ここではleaf discなど小さいサンプルの場合について説明する。
# leaf discを試験管に入れる
# この試験管に液体窒素を入れ，撹拌棒で凍った葉を細かく砕く（撹拌棒で粉々に割る）
# 十分に細かくなったら，試験管に80%アセトン4ml（吸光度が1を超えてしまう場合はもっと増やす）を注ぐ。
# 試験管にふたをする（合うフタがない場合はパラフィルムを使う）
# 試験管を振って，溶媒が緑に，サンプルの残りかすが白くなっていればOK（残りかすに緑色が残った場合は，上澄みの吸光度測定後，残りかすについて，液体窒素で凍らすところから繰り返す）
# 試験管は，氷水を張ったバットに立てておいて，温度が上がらないようにしておく
!3.遠心分離
2の試験管の本数がある程度溜まったら，遠心分離機にかけ（5分くらい），葉の残りかすとクロロフィル・カロテノイドの溶けた溶媒とを分離する。
遠心分離機に試験管を並べる際は，バランスよく並べる。
!4. 吸光度の測定
!!ガラスセルに溶媒を移す
遠心分離機にかけた試験管から，上澄みを石英ガラスセルに静かに注ぐ。うまく注げない場合は，ピペット，ピペットマンを使用し，残りかすがセルに入らないよう，注意する。
試験管に残った溶媒は，すぐに捨てず，またフタをして氷水の中に立てておく（分光光度計での測定に失敗したときの保険として）。
!!分光光度計
使用する分光光度計については，それぞれマニュアルをよく読むこと。
分光光度計では下記の波長の吸光度を測定する。
!!!Porra et al. (1989) の式を使う場合（クロロフィルa, bのみ）
* 663.6 nm
* 646.6 nm
!!!Wellburn (1994) の式を使う場合（クロロフィルa, b，カロテノイド）
* 663.2 nm
* 646.8 nm
* 470 nm
測定後，セルに残った溶媒は廃液入れに捨てる。
!5．クロロフィル（・カロテノイド）量の推定
!!Porra et al. (1989) の式
分子量で表す場合
Chl_a (nmol/ml) = 13.71 * ~~A~~__663.6__ - 2.85 * ~~A~~__646.6__
Chl_b (nml/ml) = 22.39 * ~~A~~__646.6__ - 5.42 * ~~A~~__663.6__
Chl_a+b (nmol/ml) = 19.54 * ~~A~~__646.6__ + 8.29 * ~~A~~__663.6__
----
重量で表す場合
Chl_a (ug/ml) = 12.25 * ~~A~~__663.6__ - 2.55 * ~~A~~__646.6__
Chl_b (ug/ml) = 20.31 * ~~A~~__646.6__ - 4.91 * ~~A~~__663.6__
Chl_a+b (ug/ml) = 17.76 * ~~A~~__646.6__ + 7.34 * ~~A~~__663.6__
!!Wellburn (1994) の式
Chl_a (ug/ml) = 12.25 * ~~A~~__663.2__ - 2.79 * ~~A~~__646.8__
Chl_b (ug/ml) = 21.5 * ~~A~~__646.8__ - 5.1 * ~~A~~__663.2__
Car_total (ug/ml) = (1000 * ~~A~~__470.0__ - 1.82 * Chl_a - 85.02 * Chl_b) / 198